Expresión, purificación y cristalización de la proteína rCynD de Bacillus safensis PER-URP-08

Abstract

La enzima cianuro dihidratasa (CynD) es producida por algunas bacterias y es capaz de degradar el cianuro, una sustancia tóxica utilizada en varias industrias. Para biorremediar el cianuro se necesita mantener un pH de 9, lo que hace que la CynD de algunas bacterias pierdan su actividad. Se necesita la estructura tridimensional de la CynD para entender mejor las interacciones entre sus dominios y superficies y mejorar su tolerancia al pH mediante la creación de mutantes. El objetivo de esta investigación es expresar, purificar y cristalizar la rCynD de B. safensis PER-URP-08 (rCynDPER-URP-08). Se evidenció que diferentes concentraciones de inóculo de plásmido (67,8; 135,6 y 271,2 ng/ μL) pueden transformar Escherichia coli BL21(DE3)(pLysS) con una eficiencia de 1,24; 2,3x10-1 y 7,7x10-1 ufc/ng respectivamente (p=0,49), y que se puede inducir rCynDPER-URP-08 con IPTG a 18o, 30 y 37oC (p=0,1). Así mismo, se obtuvo que la pureza de la proteína es similar al realizar una cromatografía con elución isocrática o en gradiente (p=1). Con respecto a la actividad enzimática, el Km y kcat de rCynDPER-URP-08 se mantiene a pH 9 (p=0.48 y p=0.093 respectivamente), por lo cual, debe ser considerada como candidata para la biorremediación de residuos con cianuro. En cuatro de las condiciones utilizadas se lograron obtener cristales, siendo los más grandes los generados con la adición de un stock de aminoácidos (60-95 μm), mientras que los cristales generados con los cationes divalentes tuvieron un tamaño más pequeño (27,78-29,09 μm) (p=0,0032). Dado que estos aditivos tienen la capacidad de formar sales, es necesario que un siguiente estudio analice el patrón de difracción de rayos X para determinar que los cristales son de proteínas