“Evaluación de la compatibilidad de tinciones no fluorescentes de Diffquik, Giemsa, Fastblast y de Feulgen con el Bioensayo Cometa en el ADN espermático humano.“

Abstract

La fertilidad masculina puede ser medida mediante un espermatograma convencional, sin embargo este examen no incluye la valoración de la integridad del ADN espermático. Esta variable ha sido correlacionada con las tasas de fertilización, viabilidad y desarrollo del embrión, convirtiéndose en una herramienta de importancia clínica tanto para los programas de reproducción animal como los tratamientos de fertilidad asistida. El bioensayo Cometa es capaz de determinar de una manera exacta el valor de la integridad del ADN espermático, lamentablemente este examen no es de uso rutinario por su elevado costo de implementación ya que utiliza microscopia especializada y tinciones fluorescentes para evidenciar la migración del ADN. El objetivo de esta investigación fue evaluar la compatibilidad de las tinciones no fluorescentes Diffquik, Giemsa, de Feulgen y FastBlast en el bioensayo Cometa usando un método visual y automatizado. Se utilizaron 15 eyaculados previamente seleccionados de acuerdo al manual OMS 2010, para luego ser capacitados en búsqueda de homogeneidad adecuada para la experimentación. Cada muestra fue expuesta a una gradiente de Peróxido de hidrogeno (0, 10, 30,60 y 100 mM) por 1 hora a 4°C para luego evaluar el coeficiente de daño mediante el método visual y porcentaje de ADN en la cola mediante el método automatizado. Las pendientes de la regresión lineal en el método visual indican que los valores obtenidos por la tinción control SybrGreen (m=3,69) difieren con Giemsa (m=3,45) y Diffquik (m=2,57). En el método automatizado de igual manera SybrGreen (m=0.83), Giemsa (m=0,79) y Diffquik (m=0,77). Sin embargo SybrGreen es 1,06 veces más efectivo que Giemsa en el visual y 1,05 veces en el automatizado, sugiriendo una compatibilidad con el bioensayo cometa. De igual manera SybrGreen es 1,07 veces más efectivo que Diffquik en el visual y 1,44 veces en el automatizado, concluyendo una compatibilidad solo en el método visual.Male fertility can be measured by a conventional semen analysis, however, this examination does not include the assessment of sperm DNA integrity. This variable has been correlated with fertilization rates, embryo viability and development, becoming a tool of clinical importance for both animal breeding programs and assisted fertility treatments. Comet bioassay is able to determine an exact way the value of sperm DNA integrity, unfortunately this test is not routinely used because of its high cost of implementation because it uses specialized microscopy and fluorescent dyes to demonstrate DNA migration. The objective of this research was to evaluate the compatibility of non-fluorescent dyes Diffquik, Giemsa, Feulgen and Comet FastBlast in the bioassay using a visual and automated method. 15 ejaculates were used previously manually selected according to WHO 2010 and then be trained in finding adequate homogeneity for experimentation. Each sample was exposed to a hydrogen peroxide gradient (0, 10, 30,60 and 100 mM) for 1 hour at 4 ° C and then assess the damage coefficient by visual method and percentage of DNA in the tail by automated method. The slopes of the linear regressions on the visual method indicate that the values obtained by the SybrGreen Control staining (m = 3.69) differ with Giemsa (m = 3.45) and Diffquik (m = 2.57). In the same way automated method SybrGreen (m = 0.83), Giemsa (m = 0.79) and Diffquik (m = 0.77). However SybrGreen is 1.06 times more effective than Giemsa visual and 1.05 times in the automated, suggesting a comet support bioassay. Similarly SybrGreen is 1.07 times more effective than Diffquik visual and 1.44 times in the automated, concluding compatibility only in the visual method.