Producción y marcado fluorescente de los factores de iniciación IF1 e IF3 de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

Si bien la fase de iniciación de la síntesis de proteínas ha sido extensivamente caracterizada usando unos pocos organismos modelo, pocos estudios han estudiado directamente este proceso en el patógeno M. tuberculosis, sus ribosomas o factores de iniciación. Por ello, en este trabajo se produjeron y marcaron con fluorescencia los factores de iniciación IF1 e IF3 nativos y mutantes de M. tuberculosis, para posteriormente poder estudiar su papel en la iniciación de la traducción de M. tuberculosis. Células competentes de E. coli BL21 fueron transformadas con los plásmidos correspondientes a las proteínas Mtb-IF1, Mtb-IF1D5C, Mtb-IF3 e Mtb-IF3D157C. Después, se produjeron las proteínas obteniendo eficiencias de purificación de 0.78 mg/L para Mtb-IF1 con una pureza del 87 %, de 0.375 mg/L para Mtb-IF1D5C con una pureza del 99 %, de 1.6 mg/L para Mtb-IF3 con una pureza del 80 % y de 0.57 mg/L para Mtb-IF3D157C con una pureza del 94 %. Las proteínas Mtb-IF1D5C y Mtb-IF3D157C se marcaron con el fluoróforo Atto540Q obteniendo eficiencias de marcado del 62 % y del 74% respectivamente; estas proteínas también se marcaron con el fluoróforo Alexa488 obteniendo eficiencias de marcado del 50 % y 59 % respectivamente. Finalmente, se evaluó la asociación de los factores de iniciación marcados Mtb-IF1D5C y Mtb-IF3D157C a la subunidad 30S de E. coli usando un sistema heterólogo. Se determinó que ambos factores logran asociarse a la subunidad 30S de E. coli, con mayor afinidad y en el mismo sitio de unión al 30S que sus homólogos de E. coli