Evaluación del cultivo in vitro de Oocitos Bovinos (Bos Taurus l.) utilizando la técnica Hanging Drop sobre el desarrollo embrionario

Abstract

El objetivo de esta investigación fue evaluar el cultivo in vitro de ovocitos bovinos (Bos taurus L.) mediante la técnica Hanging Drop sobre el desarrollo embrionario. Se utilizaron ovarios de vacas Holstein, obtenidos de un matadero y transportados dentro de las 4 horas posteriores al sacrificio. El complejo de cúmulos de ovocitos se obtuvo por aspiración de pequeños folículos antrales (2-8 mm) con aguja de calibre 18. Después de 15 minutos, se desechó el sobrenadante y se diluyó el sedimento en TCM199 con piruvato de sodio 0,2 mM, NaHCO3 4,2 mM, HEPES 2,64 g / l, gentamicina 50 mg / ml para la selección. Se seleccionaron ovocitos con células de cúmulos compactos multicapa y citoplasma granulado uniformemente. Los AOC se dividieron en dos grupos: para el grupo 1, se colocaron 10 AOC por 40 ul de gotas de medio en placas de Petri y se cubrieron con aceite mineral. El grupo 2 utilizó la técnica Hanging Drop, que consistió en colocar 10 AOC en gotas suspendidas de medio de 40 ul en placa petri. Para ambos grupos, se utilizó TCM199 con 20 mg / ml de FSH, 1 mg / ml de 17b-estradiol, FBS al 10%, 50 mg / ml de gentamicina, 2,2 mg / ml de piruvato sódico, 0,22 g / l de NaHCO3, incubados a 38,5 ° C, 5% CO2, 99% de humedad durante 24 horas. Se utilizaron pajitas de semen congelado de un toro certificado. El medio de fertilización fue HTF® con 0,01 mg / ml de heparina sódica, cafeína 20 mM, 6 mg / ml de BSA. El esperma descongelado se lavó con medio de fertilización a 500 g durante 5 minutos. La concentración final se ajustó a 1 x 106 espermatozoides / ml. Se utilizaron alícuotas de 15 ul de suspensión de esperma por pocillo, incubando a 38,5 ° C, 5% de CO2, 99% de humedad durante 18 horas. Después de 18 horas, los ovocitos se lavaron con HTF-HEPES® y los cúmulos restantes y los espermatozoides se eliminaron mediante pipeteo mecánico hasta que los ovocitos se desnudaron. Los presuntos cigotos se colocaron en G-TL® y las placas de cultivo se colocaron en bolsas herméticas y se mantuvieron en la mezcla: 5% CO2, 5% O2 y 90% N2 a 38.5 ° C y 99% de humedad por 7 días. La tasa de división del grupo 2 fue de 65.56%, mientras que para el grupo 1 fue de 60.18%. Se obtuvo un porcentaje promedio de mórulas y blastocistos del 59.43% y 41.93% para el grupo 2 frente al 56.67% y 36.58% del grupo 1. Hubo diferencia en la tasa de división, en la obtención de mórulas y blastocistos con grupo 2 con respecto al grupo 1. Sin embargo, no existe una diferencia significativa en los patrones de desarrollo embrionario con el tratamiento Hanging Drop incluso cuando hay una diferencia porcentual (p <0.05).