Interacción de la proteína del Síndrome de Werner (WRN) con los ARN mensajeros (ARNM) en la línea celular HELA

Abstract

El presente trabajo tuvo como finalidad evaluar la interacción in vivo, mediante ensayos de pull-down, de la proteína de Werner (WRN), con los ARNm totales, ambos aislados de células HeLa. Los dominios N-terminal, ATPasa y DEAD, de la proteína WRN fueron clonados utilizando el sistema de expresión de E. coli y luego purificados mediante cromatografía de afinidad a Glutationa Sefarosa con los cuales se realizaron ensayos EMSA (ensayo de cambio de movilidad electroforética) y RT-qPCR para esclarecer que dominios de la proteína de WRN podrían estar involucrados en la formación de complejos de unión al ARNm. Mediante ensayos de pull-down con Oligo(dT) conjugado a esferas magnéticas se determinó que la proteína de Werner era capaz de interactuar con los ARNm in vivo. Para el control de la interacción de proteínas con los ARNm se utilizaron las proteínas NXF1 y CBP80, evidenciándose la especificidad del ensayo, a través de tratamientos con VRC y ARNsa. En el ensayo EMSA se observó un patrón normal de corrida del dominio N-Terminal de la proteína WRN, pero no con los dominios DEAD y ATPasa y el análisis de las curvas de amplificación obtenidos mediante PCR en tiempo real (RT-qPCR) de los genes diana G6PD y RPS3 y derivados de los ensayos de interacción in vitro, muestran que los dominios N-Terminal, ATPasa y DEAD son capaces de interactuar con los ARNm.