“Estudio de la funcionalidad de la proteína del síndrome de Werner (WRN) en la maquinaria traduccional y alteraciones moleculares derivadas de su silenciamiento en células HeLa“

Abstract

El presente trabajo tuvo como finalidad evaluar la relación funcional de la proteína del Síndrome de Werner (WRN) con la maquinaria traduccional en células HeLa depletadas para WRN. Se utilizó el sistema lentiviral inducible en células HeLa para desregular la expresión de WRN y realizar los posteriores análisis de qPCR y Western Blot. Así mismo, se utilizó el sistema de expresión de baculovirus y el sistema de transcripción/traducción para expresar la proteína WRN. Finalmente, se realizaron los ensayos de traducción in vitro utilizando vectores reporteros. Se localizó la presencia de la proteína WRN en la fracción citoplasmática y polisomal. Además, no se encontraron diferencias entre la expresión de los ARNm de las proteínas ribosomales RPS6, RPL7a entre las células HeLa carentes de WRN y células HeLa control. Sin embargo, se encontró un aumento de ~3 veces (326%) más de la expresión de los ARNm de IDH1 en células HeLa debido quizás al estrés celular. Adicionalmente, los ensayos de traducción in vitro entre células HeLa depletadas para WRN y células control, lograron determinar que la ausencia de WRN da como resultado una disminución en la traducción de proteínas (65% menos con respecto al control) y con el uso del inhibidor de la actividad helicasa de WRN NSC-19630 (67.5% menos con respecto al control). La depleción de WRN no altera la expresión de los ARNm y las proteínas ribosomales RPS3, RPS6 y RPL7A. Así mismo, se demostró que la proteína de WRN presenta una función en la traducción de proteínas al comparar los niveles de traducción de proteínas reporteras en células HeLa shWRN y shCTR, y mediante la inhibición de la actividad helicasa de WRN. The aim of this work was to evaluate the functional relationship of the Werner Syndrome protein (WRN) in the translational machinery in HeLa cells depleted for WRN. The inducible lentiviral system was used in HeLa cells to downregulate the expression of WRN and perform the subsequent analyzes of qPCR and Western Blot. Likewise, the baculovirus expression system and the transcription/translation system were used to express the WRN protein. Finally, the in vitro translation assays were carried out using reporter vectors. The WRN protein was located in the cytoplasmic and polysomal fraction. No differences were found between the expression of mRNA levels of RPS6, RPL7a between HeLa shWRN and HeLa control cells. However, a ~ 3 fold (326%) increase in the metabolic gene IDH1 in HeLa cells was found due to cell stress. Moreover, the in vitro translation assays between shWRN HeLa and control were able to determine that the absence of WRN results in a decrease in the translation of proteins (65% less compared to the control) and with the use of the helicase activity inhibitor of WRN (NSC-19630) (67.5% less compared to the control). WRN depletion does not alter the expression of mRNAs and ribosomal proteins RPS3, RPS6 and RPL7A. Furthermore, it was demonstrated that the WRN protein has a function in the translation of proteins when comparing the levels of translation of reporter proteins in HeLa cells shWRN and shCTR, and by inhibiting the helicase activity of WRN.